本方法适用于总长度（载体+所有片段）不超过20kb的重组实验，以确保实验成功和效率的提高。在进行PCR扩增时，建议使用高保真酶，以优化目的片段引物设计和反应体系，适当调整退火温度。

载体线性化

1. 双酶切：选择两种限制性内切酶对载体质粒进行线性化处理。关于内切酶的选择，可参考第二章第一节的内容。

2. 目的片段和线性化载体的纯化回收：推荐采用切胶回收的方法。切胶时间最好控制在3分钟内，避免紫外照射对DNA造成伤害。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，应达到≥20ng/μl，并通过跑胶确认是否为单一目的条带。

3. 若回收浓度较低，可通过增大PCR/酶切反应体积，采用多管反应与单管回收相结合的方法，提高最终产品浓度。

目的片段与线性化载体连接重组

1. 连接反应体系的投入量需按说明书进行计算，所有组分的体积至少为1μl；若浓度过高，可适当稀释后使用。

感受态细胞转化

1. 连接产物应转化至DH5α、Fast-T1等克隆用化学感受态细胞。

2. 感受态细胞不可进行反复冻融，-80°C取出后建议一次用完。

3. 重组产物与感受态细胞的体积比例为1:10，推荐将10μl重组产物加入100μl感受态细胞，或5μl重组产物加入50μl感受态细胞。

4. 热激时间按照感受态细胞说明书的要求进行操作。

5. 平板使用的抗性应与转化的载体抗性一致。

6. 涂板时，菌液应先进行离心（2500×g，3min），去除多余的LB培养基，保留100μl后全部涂布，或者吸取适当的体积涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 挑取平板中适中大小的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落。

2. 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析。

3. 将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的EP管中混匀，取1-2μl作为PCR反应模板。

4. 推荐使用分别位于片段和载体上下游的一对引物进行PCR鉴定。

常见问题分析

不长克隆

1. 引物同源臂设计不当，长度应为15-20bp，GC含量以40-60%为宜。超出范围会影响重组效率，建议使用CEDesign在线工具进行设计。

2. 重组反应体系不符合要求，片段与线性化载体总长度不应超出20kb，并确保切胶回收浓度不低于20ng/μl。

3. 连接反应不当应在PCR仪中进行，设置时间和温度需依照说明书，GC含量过高或连接片段数量众多时，反应时间可延长至30分钟。

4. 使用阳性对照反应以排除其他实验材料的干扰。

5. 转化涂板操作不当可能导致效果不佳，应遵循上述程序进行感受态细胞转化操作。

假阳性情况

1. 引物设计错误可能导致假阳性，需重新设计引物进行实验校正。

2. 目的片段PCR扩增时若使用质粒模板，质粒抗性应与载体一致，投入量需降低，并进行DpnI消化和切胶回收处理。

3. 线性化载体产物需确认是否完全切割，部分酶切需调整方案后再进行切胶回收。

4. 确保重组反应体系的合规性，避免不符合要求的操作导致失败。

5. 确认PCR使用的酶适合扩增当前片段长度，并避免使用插入片段的引物进行检测。

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