实验目的

1. 学习紫外分光光度法测定生物样品中蛋白质含量的原理；

2. 掌握紫外分光光度法在测定生物样品蛋白质含量中的实验技术；

3. 熟悉UV-1700PC紫外-可见分光光度计的使用方法，并了解该仪器的主要构造。

实验原理

紫外-可见吸收光谱法是研究生物分子在190nm至750nm波长范围内的光吸收特性的一种分析方法。这种方法基于溶液中分子对光的选择性吸收，其吸收光谱由分子的外层价电子跃迁所引起。在生物样品的定性分析中，通常采用光谱比较法，通过比较未知样品与已知标准的吸收光谱特征，判断其成分类型。在定量分析中，根据朗伯-比尔定律（A=lgI0/I=εbc），样品的吸光度与物质浓度成正比，因此可以通过测量特定波长下的吸光度来计算样品中蛋白质的浓度和含量。通常，选择在最大吸收波长λmax处进行测量以提高灵敏度。

光度计结构

用于紫外-可见吸收光谱法的仪器称为分光光度计，主要由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示器五部分组成。光源发出的复合光经过单色器分光后，可获得所需波长的平行单色光，通过样品池后被吸收，最终在检测器上生成光电流，由信号显示器直接读取吸光度A。可见光区使用钨灯光源和玻璃吸收池，而紫外光区则采用氘灯光源和石英吸收池。

本实验采用紫外分光光度法测定生物样品中蛋白质的含量，主要依据如下：

1. 蛋白质能通过酪氨酸和色氨酸残基的共轭双键在275-280nm范围内吸收紫外光，因此在该波长处的吸光度与其浓度成正比，适用于定量分析。

2. 测量准确度的影响：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量及微环境不同，在280nm处的吸光度会有所差异。初步统计显示，10mg/mL浓度的多种蛋白质在该波长的吸光度范围为0.3-3.0，平均值为1.25，因此该方法在某些情况下可能会影响测量准确性。

3. 适用于含有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰物的样品，可以通过比较280nm与260nm处的吸光度差来计算蛋白质含量。常用公式为：蛋白质浓度（mg/mL） = 145A280 - 0.74A260。

4. 在稀溶液中，选择215nm和225nm进行测量，可以降低非蛋白物质对结果的干扰。实验中可使用以下公式计算浓度：蛋白质浓度（mg/mL） = 0.144(A215 - A225)。

仪器与试剂

仪器：UV-1700PC紫外-可见分光光度计；比色管（10ml的5个）；吸量管。

试剂：标准蛋白质溶液（300mg/mL），0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液。

实验步骤

1. 准备工作：

- 启动计算机，打开主机电源，启动工作站并初始化仪器；

- 在工作界面上选择测量项目，设置测量条件；

- 将空白溶液放入测量池，校零并进行标准曲线的制作。

2. 测量工作：

- 制备标准蛋白质溶液并量取后稀释，测量其在280nm处的吸光度；

- 对待测样品进行稀释并测量其在280nm处的吸光度，进行平行测定；

- 绘制吸收曲线并找出最大吸收波长，制作标准曲线进行数据处理。

数据处理

- 使用吸光度与浓度绘制标准曲线，计算得出样品中蛋白质的含量；

- 通过标准曲线得出实验结果，确保误差在允许范围内。

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